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    臨床稀有血型孕婦RHD基因分型研究

    返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-11-08 10:06【

    在RhD(-)血液樣本中存 在20%左右的Del型,其具有完整的RHD基因,Del型 個體在接受D抗原致敏后不會產(chǎn)生同種不規(guī)則抗-D抗 體。當(dāng)個體按血清學(xué)標(biāo)準(zhǔn)診斷時,需要按RhD(-) 者頻繁進(jìn)行抗- D檢 測,甚至還要輸注R h免疫球蛋 白。而對于RhD(-)孕婦來說,這無疑增加了其心 理、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,對RhD(-)孕婦進(jìn)行基因分型,可以更準(zhǔn)確的判斷其Del表型,為臨床檢測、診 斷及輸注提供更有效的保證。本文主要收集廣州番禺 城區(qū)范圍內(nèi)的RhD(-)孕婦樣本進(jìn)行血清學(xué)和基因 分型研究,從分子水平分析RhD(-)的各種表型, 補(bǔ) 充RHD基因檢測本地?cái)?shù)據(jù)庫,以期指導(dǎo)臨床孕婦 RhD(-)檢測、準(zhǔn)確鑒定Del分型,減少RhD(-)孕 婦不必要的頻繁的抗-D效價(jià)檢測和Rh免疫球蛋白預(yù) 防性輸注。

    資料與方法

    1研究對象

    收集2015年1月~2017年12月的本地區(qū)醫(yī) 院孕婦初篩RhD陰性18例血標(biāo)本,年齡22~40歲,平 均年齡31歲。用EDTA-K2抗凝試管留取2~5mL全血。

    2 試劑與設(shè)備

    2.1 試 劑

    IgG+IgM型 抗- D(法 國DIAGAST公 司 生 產(chǎn),批 號BMJ 1204D);IgM型單克隆抗- D試 劑 (德國Biotest公司生產(chǎn),批號1029060);IgG型單克隆抗- D試 劑(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司, 批號20151224)。血基因組DNA提取試劑盒(天津 秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司,批 號201708010); R H基因變異體基因分型檢測試劑盒(天津秀鵬生 物技術(shù)開發(fā)有限公司,批 號201708010);電泳緩 沖液(1×TBE天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司, 批 號201708011);瓊脂糖(北京康為世紀(jì)公司, 批號 06910K)。

    2.2 設(shè)備

    低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠),高速 離心機(jī)(北京白洋離心機(jī)廠),水浴箱(上海博訊公司),渦旋振蕩器(其林貝爾公司),9700型PCR擴(kuò) 增儀(美國ABI公司),電泳儀(北京六一儀器廠), 水平電泳槽(北京六一儀器廠),凝膠成像系統(tǒng)(珠 海黑馬公司)。

    3 檢測方法

    3.1 血清學(xué)方法

    RhD(-)確認(rèn)(試管法):取三個 不同廠家IgG或IgG+IgM性質(zhì)的抗-D試劑100μL,分 別與受檢者5%紅懸液5 0uL混勻,O型RhD陰、陽性 紅細(xì)胞作為對照管,于37℃溫水中孵育1h,然后以生 理鹽水洗滌3次,去除上層清液,每管加入100μL抗 人球蛋白試劑,離心機(jī)離心6 0s,速度1 000r/min。 結(jié)果判定:檢測管出現(xiàn)凝集現(xiàn)象則為陽性,反之為 陰性。需3種抗-D試劑均檢測為陰性才能確定樣本為 RhD(-)。Del表型鑒定:對確認(rèn)為 RhD(-)的標(biāo) 本,另外再取紅細(xì)胞標(biāo)本以IgG抗-D進(jìn)行吸收,并采 用酸放散試驗(yàn),當(dāng)吸收放散試驗(yàn)結(jié)果陽性時表明標(biāo)本為Del表型。

    3.2 血型基因組DNA提取

    使用高速離心機(jī)、水浴 箱、渦旋振蕩器等設(shè)備,嚴(yán)格按照天津秀鵬生物技術(shù) 開發(fā)有限公司生產(chǎn)的全血基因組DNA提取試劑盒說明 書操作,對抗-D篩查陰性的樣本提取基因組DNA備 用。

    3.3 基因分型

    根據(jù)RH基因變異體基因分型檢測試 劑盒,在擴(kuò)增儀上進(jìn)行基因分型試驗(yàn)。將將100μL dNTP-Buffer濃縮液、140μL去離子水 、2.0μL Taq 酶(5units/μL)和 2 5μL樣本DNA共267μL混合 液;向每個引物孔(1~24孔)各加入10μL上述混合 液。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):96℃ 2 min ,1 cycle ;96℃20 S/68℃60S ,5 cycles; 96℃20 S/65℃50S /72℃45 S,1 0 cycles;9 6℃2 0 S / 6 2℃5 0 S / 7 2℃4 5 S,2 5 cycles; 72℃2min,1 cycle。吸取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物, 加入配制好的2%瓊脂糖凝膠中并進(jìn)行電泳,電泳參 數(shù)設(shè)置為電壓100V,時間15min。電泳后用凝膠成像 儀進(jìn)行拍照、記錄與分析?;蚍中偷慕Y(jié)果判斷見表 1。

    結(jié) 果

    1 RhD(-)確認(rèn)及DeL表型檢測 用含有IgG型抗-D 檢測紅細(xì)胞標(biāo)本時,18例初篩RhD(-)標(biāo)本中, 18 例標(biāo)本均確定為血清學(xué)RhD(-),吸收放散試驗(yàn) 中確定4例DeL表現(xiàn)型(占2 2 .2%),其 中3例CCee (16.7%)、1例ccEE(5.6%)。具體見表2。



    討 論

    RhD(-)個體可能產(chǎn)生抗-D,該抗體可引發(fā)嚴(yán) 重的HDN甚至胎兒死亡。因此對于孕期婦女來說,為 了盡量避免胎兒宮內(nèi)及新生兒溶血的發(fā)生,需要密切 監(jiān)測孕婦體內(nèi)抗-D,必要時需輸注Rh免疫球蛋白進(jìn) 行阻斷。臨床上通過血清學(xué)檢測的RhD(-),可能 部分個體并非外顯子全缺失,而是由于部分缺失或某 個堿基變異導(dǎo)致。目前國內(nèi)常見的RHD基因分型 主要有放散D(DEL)、部分D與弱D等變異型,DEL 型作為國內(nèi)外較常見的RHD變異型,其分子機(jī)制已被 報(bào)道。DEL的RHD變異型基因在第9處外顯子有一處 末位堿基突變,促使RNA轉(zhuǎn)錄時內(nèi)含子被錯誤剪切,導(dǎo)致無法正常表達(dá)RHD蛋白。



     


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